Aktif üreme fazında yaklaşık 2x10⁶ hücre ihtiva eden hücre kültürünün ( insitu metot için lamelli 35 mm çaplı steril petrilerde %20-30 monolayer üremiş olmalı), test gününden 24-48 saat önce vasatı değiştirilmelidir.

İn situ Metot: Primer veya diploid hücre kültürleri için uygulanır.

 

- 4˚C’deki taze hazırlanmış colchicine kullanma solusyonundan 37˚C’deki etüvdeki 35 mm çaplı lamelli petrilerdeki 2 ml vasat içeren hücre kültürü üzerine 1 ml ilave edilir ve 4 saat inkube edilir.

- Bu süre sonunda petri mümkün olduğu kadarsallanmaksızın etüvden çıkarılır.

- Bir otomatik pipet yardımıyla yavaşca tüm kültür vasatı boşaltılır.

- 1 ml hipotonik sol. Damla damla lam üzerine ilave edilir.

- 30 dak. Etüvde bekletilir.

- Etüvden alınan petri üzerine hipotonik sol. alınmaksızın 2 ml soğuk fikzatif damlatılır.

- Oda ısısında 10 dak. bekletilir.

- Fikzasyon sonunda tüm fiksatif petriden aspire edilir.

- Lamel petriden çıkartıldıktan sonra hücrelerin bulunduğu yüzeye hafifce üflenerek hücrelerin birbirinden ayrılması sağlanır.

- Lamel üzerindeki fiksatif artığı lamelin bir köşesinden süzgeç kağıdı emdirilerek emdirilir.

- Lameller etüvde en az 10 dak. süre ile bekletilerek kurutulur. Kuruyan lameller taze hazırlanmış Giemsa kullanma sol.na daldırılarak 10-20 dak. bekletilir.

- Boyanan lameller 3 ayrı kapta bulunan çeşme suyundan 8-10 kez geçirilerek deklore edilir.

- Süzgeç kağıdına suyun fazlası emdirildikten sonra oda sıcaklığında kurutulur.

- Uzun süreli muhafazalar için lamel antellan yardımıyla temiz bir lam üzerine kapatılır.

- İnceleme ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile yapılır.

 

2- Üreme Eğrisi:

 

Amaç: Hücre kültürlerinde bir mitosis için gerekli sürenin saptanması suretiyle hücrenin üreme özelliğini belirlenmesi

 

Metot:

 

• Düzenli olarak en az 3 subkültürü yapılan hücre tiripsinize edilir.
• Hücre süspansiyonu 50 ml vasat içinde 0,5x10⁵ hücre/ml olacak şekilde hazırlanır,
• Her steril petri iin 2 ml olmak üzere hazırlanan hücre süspansiyonundan her petriye 2 ml ilave edilir.
• CO₂’li etüvde inkubasyona bırakılır.
• Hücreler tutunduktan sonra (ortalama 2 saat sonra) tutunan hücre miktarını saptamak amacıyla 2 adet petrideki hücreler tripsinize edilerek sayılır. Bu sayım başlangıç sayımı olarak kabul edilir ve her gün 2 adet petri 10 gün boyunca sayılır.
• Sayım sonucu grafik kağıdına işlenir. Eğrinin en dik olduğu bölge seçilerek bunun dikey eksende 1 doubling time’a karşıt olan bölümü işaretlenerek buradan üreme süresini gösteren yatay eksene dik iki çizgi indirilip bu çizgilerin aasında kalan kısım o hücrenin 1 mitosisi için geçen zaman olarak hesaplanır.

3-Plating Efficiency Test ( PTE Test)

 

Amaç: Hücrenin karakterizasyonu, klonlanması, yoğun kltürlrde tesbit edilemeyen sitotoksisite ve ortamın çok düşük düzeyeki yetrsizliklerinin bilinmesi

 

Metot:

 

• Aktif üreme fazındaki monolayer hücre kültürü tripsinize edilerek 1x10⁴ hücre /ml dilusyonunda hazırlanır,
• Bu süspansiyondan yararlanılarak ayrı ayrı 1x103 hücre/ml, 0,x103 hücre/ml ve 0,25x103 hücre/ml şeklinde dilusyonlar hazırlanır ve her dilusyondan 6 gözlü pleytin iki gözüne 3 ml şeklinde hücre süspansiyonu konur.
• Pleyt %5 CO2’li etüvde kıpırdatmaksızın 5-7 gün bekletilir.
• Inkubasyon süresi sonunda etüvden alınan hücre pleyti mikroskop altında incelenerek koloni oluşumları gözlenir.
• Pleyt içineki vasat dökülerek Giemsa ile boyama yapılır.
• Boyama işleminden sonra her gözde oluşan hücre kolonileri ayrı ayrı sayılarak aşağıdaki formüle göre değerlendirilir;