Hücrelere (Ana Suşlara)Uygulanan Testler

Sterilite Kontrolu

Amaç:Hücre kültürlerinde bakteri, mantar,maya, mikoplazma ve virus kontaminasyonlarının araştırılması

1-      Bakteri, Mantar ve Maya Kotaminasyonlarının Araştırılması:

   b-      Ekim sonrası bir seri 26°C diğer seri 37°C’de 14 gün inkubasyona bırakılır ve günlük kontrollarla kontaminasyonların varlığı araştırılır

2-      Mikoplasma Kontaminasyonlarının Araştırılması:

  a-      DAPI (4’, 6- diamino-2-phenyl-indole, SigmaD-1388 veya Serva 18860) veya Hoechst 33258 ile boyama;

1.      Test edilecek hücre ve negatif kontrol hücresinin ikişer adet 35 mm çaplı lamelli petride başlangıç yoğunluğu 5x10⁵ olacak şekilde kültürleri hazırlanır ve 37°C CO₂’li etüvde 24 saat inkubasyona bırakılır.

2.      24 saat sonunda her hücre için 1 petri alınarak Carnoy’s fiksatif ile hücre fikse edilerek DAPI veya Hoecht 33258 ile boyanır ve florean mikroskop altında incelenir.

3.      Mikoplasmaların varlığı ekstranucleer floresan ve hücreler arası floresan bağlantıların görülmesi ile saptanır.

DNA boyama  (Hoechst 33258)
Fluorochrome bisbenzimide (Hoechst 33258) spesifik olarak DNA’nın Adenine-Thymine (A-T) bölgesine bağlanır.Enfekte olmamış kültürler floresan mikroskopta negatif bakgrounda karşı floresan veren çekirdek şeklinde (soldaki gibi); mikoplasma enfekte hücreler hücreler arasında küçük bulutumsu bağlantılar ve değişik şekilli parlak floresan veren hücreler gibi görülür (sağdaki resim)

1- Antibiyotiksiz vasatta üremiş olan mikoplasmadan ari 3T3 hücre kültürü tripsinize edilerek 2x10⁴ hücre şekilde dilue edilerek 24 gözlü doku kültürü playtinin gözlerine 1,5 ml taksim edilir.

2- Hücreler tutunmaya başladıktan sonra (2 saat sonra) hücre kültürü sıvılarından 0,6 ml alınarak 0,2 ml şeklinde her hücre numunesinden 3 göze (BCD sıraları) konulur. Aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi numuneler ve kontroller yerleştirilir.

Pozitif kontrol olarak Mycoplasma pozitif kiti (Adenosine phosphorylase)’inin stok solusyonundan 1/10 suandırma ile çalışma solusyonunu hazırlanarak 0,2 ml/göz şeklinde konulur.

3- 24 saat sonra B ve C sıralarına mikotect reagentı (10mM 6-methylpurine deoxyriboside in phosphate-buffered saline) konulur(1/10 çalışma solusyonundan 0,2 ml/göz) konulur.

4- 72 saat sonra %10 phosphate-buffered formalin solusyonunda hazırlanmış olan %0,2 lik krital viyolet boya solusyonu ile boyanır 20 dakika oda sıcaklığında inkube dildikten sonra distile su ile yıkanarak, kurutulur.

Sonuç; hücre kontrol ve negatif kontrol gözlerinde konfluent şekilde boyanmış olarak kalmıştır. Pozitif kontrol gözünde ise tüm hücreler dökülmüştür. Test numuneleri de bu kontrol gözlerine göre değerlendirilir.

c-           Hücre kültürlerinde iki aşamalı PCR testi ile Mycoplasma aranması

Primerler:

İki aşamalı PCR reaksiyonu için toplam 5 adet primer kullanılır. İki primer (F1 ve R1) PCR ın 1. aşamasında, üç primer (F2, F2` ve R1) PCR ın ikinci aşamasında kullanılır.

Prosedür

1)      Örneklerin Hazırlanması

  i.      Hücre kültürü kabı hücreleri vasat içinde dağıtmak için hafifçe çalkalanır.

  ii.      ~5X10⁴ hücre içeren 0.5-1 ml süspansiyon 1.5 ml lik steril mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.

  iii.      12,000 x g de 10 dakika 4°C ta santrifüj edilir.

iv.      10 µl süpernatant ve hücre peleti lysis için saklanır.

2)      Prelimnary DNA ekstraksiyon (Cell Lysis) protokolu

a.       100 µl lysis buffer, 10 µl süpernatant içeren hücre peleti ile resuspanse edilir.

b.      Üzerine konsantrasyonu 2 mg/ml olan pronase E (proteinase K) solusyonundan 1 ul  ekle ve iyice karıştırılır.

c.       Karışımı 60°C de 1 saat inkubasyona bırakılır.

d.      Proteinase K yı inaktive etmek için, karışımı 95°C de 10 dakika ısıtılır.

3)      Sekonder DNA Ekstraksiyon protokolu

a.       Yukarda prelimnary DNA ekstraksiyon protokulunda tanımlanan basamakları tamamlanır.

b.      500 steril distile su ekle ve iyice karıştırılır.

c.       600 µl isoproponal ve 1 µl glycogen (20 mg/ml) ekle ve iyice karıştırılır.

d.      Solusyonu –20 C de en az 30 dakika soğutulur.

e.       DNA peletini elde etmek için 12,000 x g de 4 C de 15 dakika santrifüj edilir.

f.        Süpernatantı at. 500 µl soğuk % 75 lik etanolü DNA peletinin üzerine ekle ve iyice karıştırılır.

g.       12,000 x g de 4 C de 15 dakika santrifüj edilir.

h.       f ve g maddelerini tekrarlanır.

i.         Süpernatantı dikkatli bir şekilde uzaklaştır ve DNA peletini havada kurutulur.

j.        DNA peletini 50 µl steril distile H2O ile resüspanse edilir. Hemen kullanılacaksa DNA yı 4°C de saklanır, aksi taktirde –20°C de saklanır.

k.      Final DNA konsantrasyonu 50-250 ng/µl olmalıdır.

4)      İki aşamalı PCR reaksiyonu: PCR toplam 50 µl reaksiyon mix içinde gerçekleştirilir. Örneklerin üzerine 1-2 damla mineral oil damlatılır. (Taq polimeraz stage 1 step 1 den sonra da eklenebilir). Negatif kontrol olarak örnek (veya 1. aşama PCR ürünü) yerine distile H₂O  konulur.

a.       1.aşama PCR için reaksiyon mix

1.aşama PCR

b.      2.aşama PCR için reaksiyon mix

2.aşama PCR

c.       Termal profil

5)      PCR ürünlerinin analizi (Agorose gel electropherisis analizi)

a.       Final PCR ürünleri % 1.2 lik agaroz jelde elektroforez edilir.

b.      DNA bandları etidyum bromid boyamayı takiben UV de analiz edilir.

3- Virus kontaminasyonlarının araştırılması

a- Hemadsorbsiyon Testi:

            - %95-100 monolayer olarak üremiş olan monolayer hücre kültürü üretme vasatı boşaltılarak hücre yüzeyleri PBS ile yıkanır,

            - Alswers solusyonu içerisindeki taze kobay eritrositleri 3 kez  PBS ile 2000 devirde santrifüj edilerek yıkanır,

            - %50’lik eritrosit süspansiyonu hazırlanarak her flaska 5 ml konulur.

            -4°C’de 30 dakika inkubasyondan sonra flasklardaki eritrosit süspansiyonu boşaltılarak PBS ile iki kez yıkanır.

            - Mikroskopta rozet şeklinde oluşumlar olup olmadığı yönünde kontrol edilir. Eğer hücre yüzeyinde rozet şeklinde oluşumlar varsa pozitif, yoksa negatif olarak değerlendirlir.

b- IPEX  MAB kit ile BVD Kontrolu:

            - 96 gözlü pleytin sağ ve sol tarafındaki bir sıra gözler kontaminasyonu önlemek için boş bırakılır

            - Diğer sıralara test edilecek olan hücre süspansiyonundan 100 µl/göz konulur.

            - 48-72 saat CO₂’li etüvde inkubasyona bırakılır.

            - ¼ oranında distile su ile sulandırılmış olan PBS ile gözler inkubasyon sonunda yıkanır.

            - 80°C fırında 1 saat bekletilerek fikse kurutulur.

            - Her göze 50 µl kitteki (IPEX MAB Kit) wash fluid konularak 5 dakika bekletilir.

            - Yıkama solusyonu boşaltılarak pleyt kağıt havluya ters çevrilerek kurutulur.

            - MAB mix (1/100 dilue olmuş) her göze 50 µl miktarında konularak 25-30C’de 15 dakika lamba ışığı altında bekletilir.

            - Gözlerdeki solusyon boşaltılarak pleyt kağıt havluya ters çevrilerek kurutulur.

            - Her göze 100µl kitteki (IPEX MAB Kit) wash fluid konularak 5 dakika bekletilir ve bu işlem 3 kez tekrarlanır.

            - 1/100 dilue olmuş peroksidaz konjugat 50 µl/ göz şeklinde konularak 10 dakika lamba ışığı altında bekletilir.

            - Gözlerdeki solusyon boşaltılarak pleyt kağıt havluya ters çevrilerek kurutulur.

            - Her göze 100µl kitteki (IPEX MAB Kit) wash fluid konularak 5 dakika bekletilir ve bu işlem 3 kez tekrarlanır.

            - 50 µl/ göz şeklinde substrat konularak 15-30 dakika lamba ışığı altında bekletilir.

            - Substrat boşaltılarak tüm gözler wash fluid ile yıkanır.

Mikroskopta gözlenerek; sitoplazmaları kahverengi renkte boyanan  hücrelerin bulunduğu gözler BVD pozitif olarak saptanır.

 d- Acridine Orange ile Boyama:

 -         Hücre monolayerleri PBS ile yıkanır.

-         Carnoy’s fiksatif ile fikse edilir. 20 dakika inkubasyona bırakılır.

-         Mc Iluan buffer (pH 3,8) ile 2 dakika inkubasyona bırakılarak 3 kez yıkanır.

-         Mc Iluan buffer içerisinde % 0,5 Acridine orange solusyonu ile boyanarak 30 dakika inkube edilir.

-         Floresan mikroskop ile incelenir.

Sonuç RNA’nın kırmızı, DNA’nın ise sarı-yeşil renkte boyanmasına göre değerlendirilir.